Alternative splicing originates different domain structure organization of Lutzomyia longipalpis chitinases

BACKGROUND The insect chitinase gene family is composed by more than 10 paralogs, which can codify proteins with different domain structures. In Lutzomyia longipalpis, the main vector of visceral leishmaniasis in Brazil, a chitinase cDNA from adult female insects was previously characterized. The predicted protein contains one catalytic domain and one chitin-binding domain (CBD). The expression of this gene coincided with the end of blood digestion indicating a putative role in peritrophic matrix degradation. OBJECTIVES To determine the occurrence of alternative splicing in chitinases of L. longipalpis. METHODS We sequenced the LlChit1 gene from a genomic clone and the three spliced forms obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using larvae cDNA. FINDINGS We showed that LlChit1 from L. longipalpis immature forms undergoes alternative splicing. The spliced form corresponding to the adult cDNA was named LlChit1A and the two larvae specific transcripts were named LlChit1B and LlChit1C. The B and C forms possess stop codons interrupting the translation of the CBD. The A form is present in adult females post blood meal, L4 larvae and pre-pupae, while the other two forms are present only in L4 larvae and disappear just before pupation. Two bands of the expected size were identified by Western blot only in L4 larvae. MAIN CONCLUSIONS We show for the first time alternative splicing generating chitinases with different domain structures increasing our understanding on the finely regulated digestion physiology and shedding light on a potential target for controlling L. longipalpis larval development.

Papel das moléculas FLAG de leishmania e TGF-beta de lutzomyia longipalpis na interação parasito - vetor / Role of leishmania FLAG molecules and TGF-beta of Lutzomyia longipalpis in parasite interaction - vector

As leishmanioses constituem um grave problema de saúde. São causadas por protozoários do gênero Leishmania e sua transmissão ao hospedeiro vertebrado se dá pela picada de fêmeas infectadas do gênero Lutzomyia (Novo Mundo) e Phlebotominae (Velho Mundo). Na alimentação, as leishmanias são ingeridas pelo flebotomíneo junto com sangue e uma etapa fundamental para a manutenção da infecção no vetor refere-se à adesão dos parasitos ao epitélio intestinal com o término da digestão. Para isso, o flagelo das formas promastigotas desempenha papel essencial no processo de fixação dos parasitos às células intestinais. Estudos prévios do nosso grupo identificaram um gene codificante para uma proteína flagelar denominada FLAG que pode estar diretamente envolvida na adesão do parasito ao tubo digestivo do flebotomíneo. Visando a melhor caracterização do gene, realizou-se no presente trabalho a análise da transcrição do gene FLAG nos diferentes estágios de desenvolvimento de Leishmania infantum chagasi e Leishmania pifanoi por PCR em tempo real. Tanto L. i. chagasi quanto L. pifanoi não apresentaram diferença de expressão entre promastigota de fase exponencial de crescimento (procíclica) e de fase estacionária (metacíclica). Entretanto, em L.pifanoi, as promastigotas apresentaram uma maior expressão de FLAG do que as amastigotas que têm um flagelo interno curto. Com o intuito de verificarmos o papel de FLAG na adesão ao tubo digestivo do vetor, realizamos ensaios de inibição de adesão ex vivo e in vivo utilizando anticorpo monoclonal anti-FLAG. Os ensaios foram feitos com os pares L. i. chagasi X Lutzomyia longipalpis, Leishmania amazonensis X L. longipalpis e Leishmania major X Phlebotomus papatasi, incubando previamente os parasitos com o anticorpo anti-FLAG. Os resultados não mostraram diferenças significativas no número de parasitos aderidos entre os grupos teste e controle, nos experimentos com espécies do Novo Mundo. Entretanto, com o par natural L. major e P. papatasi, foi possível observar uma redução significativa de parasitos presentes no tubo digestivo quando os mesmos foram pré-incubados com o anticorpo. Logo, em espécies do Novo Mundo, a proteína FLAG não parece estar relacionada com a adesão de Leishmania ao tubo digestivo do flebotomíneo enquanto que no par do Velho Mundo L. major e P. papatasi, ela parece ter um papel na interação. Em paralelo foram feitos experimentos de “pull down” para a identificação de moléculas potencialmente capazes de interagir com FLAG no intestino de L. longipalpis. Para tal, foram usados extratos protéicos de células embrionárias LL5 de L. longipalpis. Observamos um grande número de ligações inespecíficas à resina ou à proteína de fusão, mas nenhuma banda pôde ser detectada ligando-se especificamente a FLAG. Isto está de acordo com os resulltados de inibição de interação ex vivo e in vivo. Os insetos são organismos que conseguem se adaptar a diversas condições ambientais. Essa capacidade de sobrevivência está apoiada em um sistema de resposta imune inata bem desenvolvido. Em nosso laboratório, uma sequência de cDNA similar a TGF-beta (Transforming Growth Factor – beta) foi identificada em fêmeas de L. longipalpis infectadas com L. i. chagasi através de experimentos de Differential Display RT-PCR (DDRT-PCR). A molécula foi seqüenciada e classificada como pertencente à família das ativinas. As citocinas da super-familia das TGF-beta são responsáveis pela sinalização e regulação de uma série de processos biológicos em diversos organismos. Essas proteínas são agrupadas em diferentes sub-familias, dentre elas a da ativina/inibina está relacionada a processo de desenvolvimento neuronal e processos de diferenciação. A análise da expressão do RNA de TGF-beta revelou um aumento significativo 72 horas após a infecção com L. i. chagasi quando comparado com fêmeas alimentadas apenas com sangue. Para avaliar o possível papel de TGF-beta na infecção por Leishmania, realizamos experimentos de infecção de L. longipalpis com L. i. infantum contendo ou não anticorpo anti-TGF-beta. Observamos um aumento de parasitos no grupo alimentado com anticorpo, indicando um possível papel de TGF-beta na ativação da resposta imune do vetor contra a Leishmania. A interação entre parasitos e seus vetores é uma etapa fundamental do ciclo infectivo. Por isso, o estudo de moléculas – chave para o desenvolvimento do ciclo de transmissão torna-se cada vez mais importante.